Microdisseção e Dissociação do Ovídeo Murine: Identificação do Segmento Individual e Isolamento de Célula Única

O oviduto murine é semelhante em função e morfologia ao tubo de falópio ^humano1. Ambos consistem em um epitélio ciliado pseudoesstratificado, consistindo de duas células residentes epiteliais historicamente descritas: células ciliadas e células ^secretas1,2. O oviduto possui três segmentos reconhecidos clássicamente: o infundibulum, a ampulla e o istmo. Em um estudo recente, Harwalkar et al. ³ investigou morfologia oviduca e expressão genética levando à expansão da categorização das células epiteliais residentes para sete populações distintas. Além disso, estabeleceram a junção ampullary-istmo como um segmento distinto do oviduct3. O método descrito aqui, que se concentra no infundibulum, ampulla e istmo, poderia facilmente ser estendido para incluir a junção ampuloso-istmímica, bem como ^2,3. A região infundibular contém o ostium, ou abertura do oviduto, e inclui a região fimbrial, bem como o talo proximal. Movendo-se em direção ao útero, em seguida é a ampola, e, em seguida, o istmo. As células ciliadas são mais proeminentes na extremidade distal da região, proximal ao ovário, ou infundibulum, enquanto as células secretary são mais proeminentes no final proximal ou segmento de ^istmo1. Ao contrário do tubo de falópio humano, o oviduto de murina é uma estrutura enrolada apoiada pelo mesosalpinx, uma extensão do peritônio ligamento ^largo1,4. Além disso, o oviduto do rato é envolto em um saco de bursal que aumenta a probabilidade de transferência de oócito para o oviduct4. A ampola é identificada como a localização da fertilização, a partir da qual embriões em desenvolvimento passam para o istmo antes de entrar no ^útero5. Os segmentos tubais têm 200-400 μm de diâmetro e as regiões mais longas e antumes têm aproximadamente 0,5-1,0 cm de ^comprimento4. Os distendes oviduto durante o ciclo estrous e a ampola e o infundibulum são mais distensíveis do que o ^istmo1.

Sobre a proliferação de células, especialmente células secretas, caracterizam lesões precursoras de tumores soros encontrados na cavidade pélvica6. Essas lesões intraeteliais peréluas precursoras surgem no epitélio oviduto apenas na região fimbrial; não se sabe por que a formação da lesão se restringe a essa região onde normalmente o tipo de célula predominante é ciliado, não ^{secretor2,7,8}. A regionalidade em termos de função fisiológica normal, bem como o aumento do interesse pela origem ovidutal do câncer de ovário9,10,11,12,13, ressalta a importância da avaliação separada dos segmentos de oviduto.

O método descrito aqui detalha a coleta de segmentos oviductais separados para análises subsequentes a jusante da expressão genética específica do segmento e função de células dissociadas. Tradicionalmente, muitos tecidos são processados para extração de RNA inteiro seguindo o fenol: método de clorofórmio ou um método de extração completa na coluna; no entanto, descobrimos que a qualidade do RNA foi mantida enquanto produzia rendimento suficiente com o método de combinação descrito. Utilizando esse método, segmentos funcionais muito pequenos do oviduto podem ser processados para análises a jusante em vez de investigar o oviduto como um todo, o que pode mascarar resultados representativos dos diferentes ^segmentos14.

As células oviductais murinas dissociadas raramente têm sido investigadas pela citometria de fluxo, provavelmente devido ao rendimento celular limitante deste tecido. Uma abordagem para superar esse problema tem sido dissociar as células, cultivá-las na cultura e, em seguida, estimular a re-diferenciação in vitro para obter números celulares apropriados para análise celular a jusante15,16,17,18. Uma limitação a essa abordagem é o tempo ex vivo e microambiente alterado na cultura, ambos os quais provavelmente mudam a expressão genética. Há também a suposição de que a reeferirrecialidade morfológica tem a mesma assinatura transcricional e proteômica que estava presente no animal intacto. O método de dissociação atual foi projetado para alcançar o maior número de células epiteliais em uma população de células ovidutoras heterogêneas, mantendo a diferenciação de células únicas. Além disso, a abordagem não enzimática provavelmente limita a perda de proteínas da superfície celular.

Todos os procedimentos e manejo de animais foram aprovados pela Universidade da Califórnia, pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais de Riverside e estavam de acordo com as diretrizes da Associação Americana de Cuidados de Animais de Laboratório, do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos e dos Institutos Nacionais de Saúde. O método descrito utilizou camundongos adultos C57BL/6. Todos os animais foram eutanizados por decapitação antes da colheita de tecidos.

NOTA: Uma visão geral do protocolo, que usa um corante azul para auxiliar na dissecção eficiente e descoilação do oviduto, é mostrada na primeira figura (Figura 1).

Figura 1: Visão geral do método de microdisseção. (A) O painel esquerdo mostra a estrutura intacta da qual a maior parte da almofada de gordura ovariana e os restos de tecido conjuntivo ao redor do oviduto foram removidos. Depois disso, a adição de azul toluidina ajuda a distinguir as bobinas do oviduto (painel médio). O painel direito mostra estruturas após a remoção do ovário. (B) Um oviduto descamado com curvas internas para determinar onde cada segmento começa e termina. c Desenho animado da segmentação utilizada (não desenhada para escala). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação da superfície de dissecção

1. Fixar um pedaço de cera dentária em uma placa de Petri com adesivo e deixá-lo secar (Figura 2A). Higienize o prato com 70% de etanol. A superfície está pronta para dissecção.

2. Macrodisseção do ovário, oviduto e útero

1. Imobilize a placa de Petri contendo a cera dentária em uma plataforma fria de escolha (por exemplo, uma bolsa de gelo mantida a -20 °C antes do uso) sob um microscópio de dissecção quando pronta para dissecção (Figura 2A).
2. Desinfete a superfície ventral do animal com 70% de etanol. Abra a cavidade abdominal e pélvica com uma tesoura de dissecção estéril e mova o trato gastrointestinal para um lado para localizar o útero bihornal dorsal. Siga cada chifre uterino rostrally para localizar cada oviduto e ovário envolto na almofada de gordura uterina, encontrada logo abaixo do rim (Figura 2B,C).
3. Extirpa ambos os ovidutos laterais com os ovários e uma porção do chifre uterino distal ainda preso usando tesoura de dissecção. Corte cada chifre uterino lateral com aproximadamente 1-2 cm da buzina ainda presa ao ovídeo enrolado e ovário (Figura 2D). Submergir o tecido imediatamente em 2 mL de meio de dissecção a frio (ver Tabela de materiais).

Figura 2: Macrodisseção do ovário e da configuração de dissecção. O oviduto está localizado dorsalmente na cavidade pélvica na base do rim dentro da almofada de gordura ovariana (B). Localize a bifurcação uterina na cavidade pélvica (C) e siga o chifre uterino lateral para localizar o contínuo uterino-ovulo (B). Remova essas estruturas cortando através de um chifre uterino e dissecção grosseira. Coloque na plataforma de dissecação (A) e afixe a porção uterina à cera dentária com uma agulha (A e D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: Deixe chifre uterino suficiente intacto e anexado ao oviduto para permitir a fixação à plataforma de dissecção (Figura 2D).

4. Fixar o tecido uterino à cera dentária com uma agulha estéril de 25 G para fixar tecido para dissecção (Figura 2A,D e Figura 3A). Trabalhando sob o microscópio de dissecção, limpe e disseca o bloco de gordura ovariana e o tecido conjuntivo para permitir uma visualização clara do oviduto (Figura 3B).

Figura 3: Passo a passo oviduto microdissection. Após a remoção de gordura remanescente e tecido conjuntivo (A,B), adicione azul toluidina ao tecido (C) e depois lave para facilitar a visualização e posterior remoção do ovário e descoilamento do tubo (D-H). O infundibulum pode ser encontrado ao lado do istmo proximal e junção uterina-tubal (UTJ). Puxe levemente a extremidade distal enquanto corta no mesosalpinx para desenrolar e revelar as voltas endógenas do oviduto (H) para orientar para a segmentação adequada. Figura A-C barra de escala = 500 μm, barra de escala D-H = 400 μm (I) Desenho animado dos vários segmentos (não atraídos para escala). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Utilizando uma seringa de 1 mL, dispense e incuba o oviduto afixado no útero em 1-2 gotas de solução de corante azul toluidina de 1% para 30 s-1 min. Enxágüe com soro fisiológico a frio tamponado de Fosfato (DPBS) e remova todo o líquido (Figura 3C).
6. Puxe levemente o ovário do oviduto enrolado e corte na membrana bursal e ligamento largo para remover o ovário do ovídio sem comprometer o tecido tubal (Figura 3D,E).
   NOTA: O ovário não está ligado ao oviduto, mas envolto na membrana bursal com o oviduto (Figura 2D) e conectado ao lado lateral do útero através do ligamento largo.

3. Microdisseção e segmentação do oviduto

1. Localize a extremidade distal e fimbrial do oviduto encontrado lateralmente à junção uterina-tubal (UTJ). O oviduto coils de volta em si mesmo; portanto, a extremidade fimbrial pode ser localizada lateralmente à extremidade proximal e é um ponto de partida apropriado para orientar para a descoilação do oviduto (Figura 3F,I).
   1. Enquanto puxa suavemente o tubo, corte o mesosalpinx (Figura 3I) com micro-tesoura de forma de mola para desenrolar o oviduto (Figura 3G).
2. Uma vez desembrado, corte o tubo para produzir as regiões infundibular, ampullary e ítmica (Figura 3H).
   1. Após a excisão do infundibulum (extremidade fimbrial e talo proximal), extirgue a região ampullary cortando após a segunda curva proeminente do tubo (corte entre as curvas dois e três, aproximadamente 1 cm de comprimento). Por fim, corte a parte restante para a UTJ, que é a região ítmica (Figura 3H).
      NOTA: O oviduto não vai desenrolar completamente em uma estrutura reta. O tubo manterá suas curvas (Figura 3H)³. Com base nas curvas subsequentes após a região amprária, pode-se segmentar ainda mais o tubo restante para a junção ampulo-istmímica e ^isthmus3. Após a excisão de ampulla, corte entre as curvas cinco e seis para obter a junção ampulo-ítmica; o tubo restante (gire seis para o início do UTJ) é o ^isthmus3.
3. Imediatamente o congelamento de segmentos de tecido dissecado em nitrogênio líquido para isolamento ou correção de RNA e processe cada segmento para incorporação orientada e análise imunohistológica.
   1. Adicione 200 μL de reagente de extração de RNA frio e 1:1 mistura de contas de homogeneização (ver Tabela de materiais) ao tecido se proceder à extração de RNA (ver passo 5.1).

4. Dissociação de Oviduto

1. Continuado a partir da etapa 3.1.1 acima) Para a dissociação ideal do epitélio, abra o oviduto nas áreas sempre que possível (ou seja, infundibulum e ampulla) para expor o epitélio luminal (Figura 4A).

Figura 4: Dissociação celular oviduto, parte 1. Desenho animado mostrando como expor o epitélio distal para a dissociação celular ideal (A) e uma imagem mostrando a maneira mais fácil de usar a malha de 1 ^mm2 (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Começando na região fimbrial, usando fórceps como alavanca, corte o tubo longitudinalmente com uma tesoura em forma de mola.

2. Pique as porções abertas e o restante em segmentos (~1-2 mm de tamanho) e adicione 5 mL de tampão de dissociação quente e não enzimático (ver Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C.
   1. Resuspenda as peças de tecido e células dissociadas com um pipettor de lâmpada a cada 3 minutos por 9-10 min. Diluir o tampão de dissociação 1:1 com meio de dissecção a frio.
3. Recolher as células por centrifugação (350 x g, 3 min, 4 °C). Resuspenquei as células em 2 mL de tampão de lise RBC por 2 min a temperatura ambiente e, em seguida, dilua 1:1 com meio de dissecção a frio.
4. Colete as células por centrifugação (350 x g, 3 min, 4 °C) e resuspende em 5 mL de solução de pronase fria.
   1. Incubar em meio de digestão de pronase e resuspenir os aglomerados celulares com um pipettor de lâmpada a cada 3-5 minutos até que uma única suspensão celular seja alcançada (~25-30 min).
      NOTA: Esta etapa é melhor executada em uma placa de cultura de tecido ou frasco para permitir observação constante prevenindo a superexposição desnecessária à pronase.
5. Passe as células através de uma macro-malha estéril (malha de 1 mm x 1 mm afixada em um tubo cônico com um elástico (Figura 4B)) para remover quaisquer pedaços de tecido não dissociados restantes. Colete as células por centrifugação (350 x g, 3 min, 4 °C) e resuspensá-las em um meio frio apropriado para análise a jusante (por exemplo, tampão FACS se continuar com a coloração para citometria de fluxo).

5. Extração de RNA de segmentos ovidutores

1. Homogeneize amostras congeladas em 200 μL de reagente de extração de RNA em um homogeneizador de tecido de liquidificador de bala de contas no nível 12 para dois intervalos (3 min cada) a 4 °C usando a mistura de contas de aço inoxidável.
   NOTA: Para preservar a integridade do RNA, as amostras devem ser imediatamente movidas do estado congelado por snap para o reagente de extração de RNA e não pesadas.
2. Resumidamente centrífuga homogeneizar a 100-200 x g em uma centrífuga de mesa por aproximadamente 5 s à temperatura ambiente para separar o líquido das contas. Transfira o supernatante para um tubo fresco.
3. Adicione mais 200 μL de reagente de extração de RNA às contas para recuperar mais amostras, seguido de centrifugação (100-200 x g, 5 s, temperatura ambiente). Combine os supernantes.
   NOTA: Use uma pequena ponta de pipeta (a maioria das pontas p200 são adequadas) para evitar a recostura das contas ao remover o supernatante.
4. Siga as diretrizes do fabricante para separar e precipitar o RNA. Amostras representativas foram precipitadas durante a noite a -20 °C com isopropanol 100% (aproximadamente 2:1 volume, isopropanol: fase aquosa recuperada).
5. Transfira o RNA completo precipitado juntamente com a solução para uma coluna de giro de ligação RNA e centrífuga para 30 s a 9.500 x g. Purifique o RNA na coluna de acordo com as diretrizes do fabricante e, em seguida, elute o RNA em 20 μL de água livre de nuclease. Avalie a qualidade/quantidade em um espectrofotômetro microvolume e/ou bioanalítulo.

O protocolo de dissociação descrito produz 100.000-120.000 células por rato com agrupamento de ambos os ovidutos. O método é suave o suficiente para deixar intactas as bordas celulares multi-ciliadas, permitindo uma distinção entre células multi-ciliadas e células secretas, e verificando se o método de digestão é suave o suficiente para evitar a desfagnáslica. Imagens representativas de imunofluorescência na Figura 5 mostram pequenos aglomerados de células após a etapa 4.2.1, fixadas por 3 min em 4% de paraformaldeído (PFA)/ DPBS, lavadas com 1% de albumina bovina de soro (BSA)/ Túnica salina tamponada tris (BTBST) e manchada em suspensão. Resumidamente, as células foram permeabilizadas por 15 minutos à temperatura ambiente em 0,5% TritonX-100/BTBST, lavado em BTBST, saciado para fluorescência de fundo por 2 h à temperatura ambiente em 20 mM de glycina/ DPBS, lavado em BTBST, e depois bloqueado por 1h à temperatura ambiente em 5% BSA / 0,1% TritonX-100/ TBST. As células foram então incubadas no anticorpo primário a 4 °C durante a noite no BTBST (occludina anti-rato do rato (1:2000); tubulina acetilada anti-rato de coelho (1:1000)) seguida por várias lavagens no BTBST. Anticorpo secundário foi adicionado por 1 h à temperatura ambiente em BTBST (anti-rato de cabra IgG Alexa Fluor 555 (1:1000); anti-coelho de cabra IgG Alexa Fluor 488 (1:1000)), lavado várias vezes no BTBST, uma vez em DPBS, e depois incubado em mancha nuclear por 20 minutos à temperatura ambiente (1:2000, Hoescht 33342) seguido de uma lavagem em DPBS. As células foram resuspengidas em 80 μL de meio de montagem de antifado e deixadas durante a noite no escuro antes da imagem (Figura 5A). A Figura 5B mostra células no final do protocolo de dissociação. Avaliações de viabilidade foram feitas ao longo do protocolo, e imagens representativas são mostradas na Figura 5B-D. O iodeto de propídio foi adicionado às 1:100 diluição, e as células foram imediatamente observadas em um microscópio de fluorescência composto invertido (Figura 5C, mancha vermelha). Cílio permaneceu intacto em pequenos aglomerados celulares (Figura 5A) e suspensões de células únicas (Figura 5E) com muitas células observadas para ter cílios ainda batendo (Suppl. Vídeo 1).

Figura 5: Dissociação celular oviduto, parte 2. Imagens fluorescentes e de contraste de fase de um aglomerado celular positivo para occludina (vermelho), núcleos (azul) e tubulina acetilada (verde). A borda apical ciliada (verde em IA e AV) permanece intacta em todo o protocolo e suporta mais digestão para células únicas (E). IA: mesclagem, AII: canal vermelho, AIII: canal azul, AIV: contraste de fase, AV: canal verde. Após uma breve incubação de pronase, a maioria das células são solteiras. A coloração do iodeto de propídio (PI) mostra aproximadamente 93% de viabilidade. (B) Campo brilhante, (C) vermelho canal PI positivo, (D) mesclagem. (E) o início da fusão mostra uma borda ciliada intacta em uma única célula dissociada. Tais células tinham ativamente batido cilia (ver Suppl. Vídeo 1). As imagens foram tiradas em um microscópio de fluorescência composto invertido. Figura barra de escala AI-V = 20 μm, barra de escala B-D = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O protocolo de isolamento do RNA descrito dá rendimento e pureza suficientes necessários para rt-qPCR segmental e RNAseq. Os resultados mostram que este método produz 800-1200 ng RNA por segmento (Figura 6A) exceto para amostras infundibulares onde a junção de dois animais pode ser necessária para o rendimento adequado para ensaios a jusante. Os resultados apresentados para o infundibulum são agrupados de dois animais, totalizando quatro regiões infundibulares (Figura 6). Este protocolo é bem sucedido na obtenção de RNA puro, inicialmente analisado pelo espectrômetro microvolume e ainda por bioanalítulo (Figura 6B,C). As amostras têm uma razão de absorção de 260/280 nm entre 1,8 e 2,0 (Figura 6B) típica de espécies puras de nucleotídeos de ^RNA19. Foram colhidas razões de absorção (260/230 nm) para cada amostra com critério de inclusão entre 1 e 2,2, representante de contaminação limitada de reagentes de isolamento (dados não apresentados)¹⁹. A bioanálise das amostras mostrou alta integridade do RNA, com número de integridade de RNA avaliado (RIN) acima de sete (Figura 6C), apropriado para a expressão a jusante e análise de sequenciamento20.

Figura 6: Avaliação de qualidade do RNA segmental. O RNA inteiro foi avaliado para rendimento (A) e qualidade (B,C) por espectrofotômetro microvolume e bioanalzer. RIN: Número de integridade do RNA, conforme avaliado pelo bioanalílise. As barras são a média ± desvio padrão (SD), N = 12 amostras por segmento de duas extrações separadas de RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo suplementar 1: Imagens de células vivas de espancamento de cílios em células dissociadas. Batendo cilia após digestão de pronase. Vídeos foram feitos em um microscópio composto invertido. Clique aqui para baixar este vídeo.

Os três segmentos do oviduto são histologicamente, morfologicamente, e funcionalmente ^{distintos1,2,3}. O epitélio varia muito de uma extremidade do oviduto para a outra. As células ciliadas dominam na extremidade fimbrial/infundibular, enquanto as células secretas dominam na região ítmica1. Embora este gradiente geral tenha sido reconhecido há algum tempo, o trabalho recente tem descoberto mais distinções entre os segmentos ovidutos. Assim, enquanto as células ciliadas se tornam menos frequentes na extremidade proximal do tubo, há uma queda acentuada em seu número (de aproximadamente 60% a 10% de ciliação) transitando da ampola para a junção ampulo-ítmica3. Além disso, as populações de células epiteliais nos segmentos proximal e distal são derivadas de linhagens distintas do ^{desenvolvimento1,2,3}. As células epiteliais distal do infundibulum e da ampulla não contribuem para populações proximais de células epiteliais no istmo, como mostrado pelo rastreamento de linhagem de marcadores epiteliais. No dia embrionário 12.5 (E12.5), as células epiteliais oviducais têm uma linhagem distinta independente do marcador proximal de células epiteliais, ^PAX22. Essas descobertas, além da população celular diversificada entre os diversos segmentos, enfatizam ainda mais a necessidade de investigar os segmentos de forma independente. O método descrito detalha um protocolo passo-a-passo de descontrair e segmentar o protocolo de identificação, conforme os três segmentos historicamente descritos (infundibulum, ampulla e istmo). Devido ao recente estabelecimento da junção ampullary-ítmica como segmento de oviduto definitivo, priorizou-se a identificação e coleta das três áreas clássicamente descritas. No entanto, o método pode ser estendido para incluir uma coleção separada da junção ampuloso-ítmica, conforme descrito ^acima3.

O uso do corante azul e a localização do infundibulum é um passo crítico para desenrolar o oviduto de forma rápida e eficiente. O corante azul destaca o ostium e as bobinas do tubo, permitindo um descodificante e de coleta mais rápido e eficiente. A localização inicial das áreas de ostium orienta uma para as áreas distal (infundibular) e proximal (ímica) do oviduto ao longo da uncoiling. Além disso, manter a porção proximal de chifre uterino afixada na plataforma de dissecção durante a uncoiling permite que o cirurgião use ambas as mãos para os delicados passos de dissecção. A remoção inicial do oviduto enrolado e as tentativas de desenrolar esta estrutura sem tornar o tubo imóvel ou sem o uso do corante podem facilmente levar à confusão em relação às extremidades distal e proximal ou causar quebra do tubo. A quebra do tubo é fácil, por isso deve-se exercitar o cuidado ao desenrolar, uma vez que a quebra tornará a segmentação reprodutível inalcançável. O uso de micro-tesouras de alta qualidade, de forma de mola, é altamente recomendado para alcançar os melhores resultados.

Avaliar a assinatura da expressão genética nos diversos segmentos do oviduto, por exemplo, durante o ciclo estrous e em resposta a hormônios administrados e citocinas, provavelmente produzirá uma compreensão muito melhor de como o oviduto muda em resposta a esses estímulos. Esses dados também podem lançar luz sobre quais fatores contribuem para a transformação epitelial. O protocolo de extração de RNA aqui foi desenvolvido para obter a maior quantidade e qualidade possível para este tecido de tamanho limitado e estrutura tubal resistente. A homogeneização descrita, a precipitação do RNA e o uso conjuncional do fenol: os métodos de purificação do clorofórmio e da coluna foram considerados mais eficientes na obtenção da qualidade e quantidade adequadas de RNA para análise a jusante. Os segmentos oviducais não foram pesados e segmentos inteiros foram imediatamente processados para homogeneização tecidual, a fim de evitar qualquer aquecimento do tecido que leva à degradação do RNA. Além disso, como os pequenos segmentos tubais requerem múltiplas etapas de homogeneização, é fundamental garantir que a homogeneização seja realizada a 4 °C para preservar a integridade da amostra. Como este método é suficiente para produzir rendimento adequado para análise a jusante, uma futura aplicação dessa técnica seria realizar rnaseq segmental, não relatado anteriormente, o que contribuiria muito para a nossa compreensão da fisiologia oviduct.

Durante o desenvolvimento do protocolo de dissociação celular, descobrimos que digestões robustas e/ou enzimáticas longas causaram perda demonstrativa de cílios. Nós, portanto, nos concentramos no desenvolvimento e alcançado, um método que preservasse a morfologia celular. Melhorias no rendimento de células únicas, como descrito aqui, permitirão análises multiplexadas mais robustas e imediatas dos diferentes tipos de células epiteliais e estromais por citometria de fluxo. O uso de um protocolo de dissociação não enzimática seguido de uma breve incubação em pronase também é provável que melhore a preservação de antígenos de superfície celular sobre métodos de dissociação utilizando métodos de digestão longos ou ^robustos2,18. A análise de sequenciamento de células únicas requer muito menos células em comparação com painéis de citometria de fluxo multiplexado2,21. Assim, o sequenciamento de células únicas dos três segmentos descritos do oviduto pode ser possível com o protocolo descrito.

Como o oviduto não pode ser arquivado ao longo de toda a sua extensão, uma limitação potencial do método atual poderia ser que as células que formam o epitélio do istmo mais estreito teriam reduzido a exposição aos reagentes de dissociação e, portanto, podem não estar presentes na suspensão final na mesma proporção que in vivo.

Devido ao enrolamento do oviduto, a orientação para análises imunohistoquímicas de todos os segmentos oviducais pode ser ^desafiadora3. No entanto, a dissecção do segmento descrita seguida de incorporação orientada dos segmentos oviductos permite uma análise de imagem longitudinal e transversal mais abrangente sem ter que separar em série por todo o tubo enrolado intacto. Além disso, o corante azul utilizado para descoilação, auxilia na orientação correta durante a incorporação dos pequenos segmentos tubais.